A gyanta teljes duzzanata
Mérjünk be 2,0 g üres Wang gyantát egy tiszta és száraz reakciócsőbe, adjunk hozzá 15 ml DMF-et, szobahőmérsékletű aktiválás 30 perc kb.
Vegye ki az első aminosavat
Szobahőmérsékleten szűrjük ki az előző lépésből származó oldószert egy homokmagon keresztül, és adjunk hozzá 1 mmol 5 moláris felesleget C Első aminosav a végén, 5-szörös moláris felesleg DMAP, 5 moláris felesleg DIC, DMF Do oldószer szobahőmérsékletű reakció 3 óra. Használja a reakció befejeződése után DMF Mossuk 4-6-szor, minden alkalommal 5-6-szor ml-ben. Ezután adjunk hozzá megfelelő mennyiségű piridint és ecetsavanhidridet 1:1 térfogatarányban, és reagáltatjuk 30 percig. Használja a reakció befejeződése után DMF Mossuk 4-6-szor, minden alkalommal 5-6-szor ml-ben. (hatás: blokkolja az aktív mikropontokat a nem reagáló üres gyantán.)
Fmoc Védőcsoportok távozása
Távolítsa el az oldószert az előző lépésből szívószűréssel, és adjon hozzá 10 ml 20% piperidin DMF-et. Az oldatot a gyantához adjuk, N2 Keverje 10 percig Végül szűrje le az oldatot, és adjon hozzá 10 ml 20% piperidin DMF oldatot, N2 Fújja és keverje 5 percig, majd szűrje ki az oldatot, és ismételje meg ezt a műveletet kétszer. DMF Mossuk 4-szer, mossuk 2-szer metanollal, minden alkalommal 5-6-szor ml-rel.
A ninhidrin eltávolító hatásának tesztelése
Vegyen ki egy kis mennyiségű gyantát, mossa át háromszor metanollal, adjon hozzá ninhidrint, KCN-t, egy csepp fenolos oldatot, 105-110 fok Melegítés 5 perc, A sötétkék színezés pozitív reakció, ami azt jelzi, hogy az eltávolítás befejeződött és a reakció következő lépése végrehajtható. Ha színtelen, az azt jelenti, hogy a védőcsoportot nem távolították el teljesen, és a fenti védőcsoport-eltávolítási műveletet meg kell ismételni.
Ezután a második aminosav és az Fmoc Protection csoport eltávolítása
Mérjük le a 3-szoros moláris felesleget C A második aminosav a végén, 3-szoros moláris feleslegben HBTU és 3-szoros moláris feleslegben HOBT A reakciócsőben adjon hozzá megfelelő mennyiségű DMF-et. Miután az oldat teljesen feloldódott, adjon hozzá 10-szeres moláris felesleget (tiszta) DIEA-t, szobahőmérsékletű reakció 40 perc, használjon DMF-mosást 4-6-szor, alkalmanként 5-6-szor. Vegyünk egy kis mennyiségű gyantát használjon Tesztelje ninhidrin detektáló reagenssel, és színtelennek fog tűnni, majd adjon hozzá 10 ml 20% piperidin DMF oldat eltávolítása Fmoc, ezt kétszer 10 percig, 5 percig, használat után DMF Mossuk 4-szer, mossuk 2-szer metanollal, 5-6-szor minden alkalommal ml. Vegyen ki egy kis mennyiségű gyantát. Használja a ninhidrin érzékelő reagenst a kimutatására. Ha az észlelés kék, akkor folytathatja a reakció következő lépését.
Analógia alapján ismételje meg a 2.6 lépést, amíg a szintézis N nem lesz. Távolítsa el az utolsó aminosavat az Fmoc Protect bázis végén, majd engedje le.
Gyantaleválasztás és tiszta termék elválasztás és kimutatás
Végül használjon trifluor-ecetsavas vágóoldatot (95% TFA:2% TIS:2% EDT: 1% H2O). Vágja le 2 órát, Szűrje le a reakcióoldatot leszívással, és kapja meg a polipeptid trifluor-ecetsavas oldatát. A lizátumot szárítsuk meg nitrogénnel, amennyire csak lehetséges, éterrel csapjuk ki, centrifugáljuk, majd éterrel mossuk 3 másodpercig. kb. ötször fehér szilárd anyagot kapunk. Tiszta vízben való feloldás után HPLC Sótalanítsa és tisztítsa, fagyasztva szárítsa, és kicsapja a kristályokat, majd vegyen egy kis mennyiségű MS-elemzést.